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膜生物反应器处理含环丙沙星合成废水(1)

返回列表发布人:tianrenhn   发布时间:2018-10-10  11:37:25

环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)作为第三代氟喹诺酮类抗生素, 因具有广谱抗菌活性而得到广泛应用, 这也导致越来越多的CIP进入环境之中.据报道, 近年来CIP在生活污水、制药废水、农业废水和地表水中均被频繁检出.该物质化学性质稳定,河南发酵废水处理, 很难被微生物降解, 因此其抗菌生物活性在环境中残留时间较长.有研究表明, CIP的大量使用甚至滥用致使致病菌长期处于亚抑菌浓度中, 致病菌很容易突变产生耐药性.因此, 近年来CIP等新型污染物引起的微污染问题已引起了人们的广泛关注.

  CIP在环境中持续地迁移扩散, 当达到一定浓度后会对某些敏感微生物的生长产生抑制, 甚至直接杀死它们, 从而改变土著微生物区系和数量, 影响微生物群落结构分布.同时, 环境中残留的CIP等氟喹诺酮类抗生素能促进抗性基因(antibiotic resistant genes, ARGs)的产生.目前, 在河流、湖泊、土壤、底泥等不同介质中就检出了由于抗生素作用而产生的抗性基因和耐药细菌.抗性基因的传播和扩散可能会加快抗药性菌群的大量繁殖, 且细菌抗药性一旦生成就很难在短时间内消失, 对微生物群落结构形成了潜在的威胁.抗性基因作为一种新型污染物, 其危害比抗生素本身要大, 这给人类的身体健康和生态环境安全带来了不可预测的风险.近年来, 河南发酵废水处理,围绕着CIP对水或土壤中微生物群落的影响开展了较多的研究, 但大多集中于CIP痕量水平(ng ·L-1或μg ·L-1级别), 关于高浓度CIP(mg ·L-1水平)对活性污泥中微生物群落结构、功能微生物数量及抗性基因丰度的影响还少有报道.

  Xie等针对某抗生素生产废水开展研究, 发现废水中CIP浓度很高, 达到5.06 mg ·L-1, 生化处理对CIP去除效果不佳, 处理出水中残留浓度仍高达3.23 mg ·L-1; 且该系统对有机物和氨氮去除效果较差, 推测是废水中的CIP对活性污泥中功能微生物造成了影响.此外, 本实验室前期研究也发现CIP对膜生物反应器(membrane bioreactor, MBR)运行效能会产生负面影响.

  本研究旨在通过MBR处理CIP模拟废水实验, 考察不同CIP投加浓度下MBR中微生物群落结构和功能微生物丰度的变化; 探讨CIP-ARGs, 包括gyrA、gyrB、parC和parE在CIP选择压力下的变化情况, 以期为CIP生产废水的无害化处理提供数据支撑.

  1 材料与方法1.1 实验用水

  MBR进水中含有200 mg ·L-1葡萄糖、256.67 mg ·L-1无水乙酸钠、94.17 mg ·L-1硫酸铵和17.50 mg ·L-1磷酸二氢钾(C :N :P=100 :5 :1), 其COD、氨氮和磷浓度分别约为400、20和4 mg ·L-1.整个实验分为4个工况, 共运行132 d, 运行工况1(1~33 d)、2(34~66 d)、3(67~99 d)、4(100~132 d)条件下分别向上述MBR进水中投加CIP浓度为0、5、10和15 mg ·L-1.所用CIP(上海阿拉丁生化科技股份有限企业)、葡萄糖、无水乙酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾等药剂均为分析纯.

  1.2 实验装置与运行条件

  MBR主要由有机玻璃容器(长方体结构, 有效体积为12 L)、膜组件(日本三菱丽阳株式会社的中空纤维膜, 膜平均孔径为0.1 μm, 膜面积为0.09 m2)和曝气装置组成(图 1).反应器中接种污泥取自某生活污水处理厂好氧膜池, 经稀释水洗和稀释后, 调整反应器中初始MLSS为6.2 g ·L-1.整个MBR装置和进水桶采取遮光处理, 避免CIP发生光解.反应器连续进水,河南发酵废水处理, 流速为25 mL ·min-1; 间歇抽吸出水, 每连续出水5 min后停止出水1 min, 以减缓膜污染, 出水流速为30 mL ·min-1.整个实验中, 反应器水力停留时间(HRT)为8 h, 溶解氧为2~4 mg ·L-1, pH为7~8, 水温为25~30℃, COD容积负荷约1.2 kg ·(m3 ·d)-1, 除工况1视情况周期性排泥外其余3个工况几乎没有排泥(检测时所取混合液体积与整个MBR体积相比, 影响甚微, 可忽略此污泥损耗).

  图 1


图 1 实验装置结构示意

  每个工况下周期性取样分析常规水质指标和CIP的变化情况, 并取污泥样品密封避光保存于-70℃超低温冰箱内, 用于分析微生物群落及其抗性基因的变化.

  1.3 分析项目与方法1.3.1 高通量测序

  分别于第33 d(运行工况1末)、36 d和66 d(即工况2的第3 d和33 d)、69 d和99 d(即工况3的第3 d和33 d)、102 d和132 d(即工况4的第3 d和33 d)采取污泥样品, 委托生工生物工程(上海)股份有限企业进行高通量测序.

  泥水混合物3 000 r ·min-1离心去上清液, 沉淀固体部分使用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒(OMEGA)进行DNA提取, 之后用Qubit?2.0荧光计(Invitrogen)检测DNA浓度, 用琼脂糖凝胶(美国UVP)检测DNA完整性, 用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒(Life)对基因组DNA精确定量.PCR扩增采用融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物341F(CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTCTA ATCC).

  1.3.2 抗性基因检测分析

  采用PowerSoil? DNA Isolation Kit试剂盒(MO BIO)并结合液氮冷冻研磨法对样品的基因组DNA进行提取.PCR的扩增引物如表 1所示.PCR反应体系:DNA模板1 μL, 2×Taq酶12.5 μL, 上下游引物(10 μmol ·L-1)各0.5 μL, 10.5 μL ddH2O, 反应体系总体积为25 μL.PCR反应程序:94℃预热5 min, 30个循环:94℃变性30 s, 退火温度(gyrA, gyrB:55℃; parC,河南发酵废水处理, parE:57℃; 16S rRNA:60℃)30 s, 72℃延伸30 s, 最后72℃停留7 min.再采用Universal DNA Purification Kit(TIANGEN)试剂盒对CIP-ARGs的PCR产物进行纯化回收, 并委托中国科学院南京土壤研究所对纯化的PCR产物进行定量分析.


  表 1 引物信息 Table 1 Primer information

  1.3.3 其它指标检测

  CIP浓度采用高效液相色谱仪HPLC(LC-2010A型, 日本岛津)测定:色谱柱为ODS-2, 5 μm 4.6×250 mm(WondaCract, 日本岛津); 检测器为紫外可见吸取检测器(UV-Vis), 波长为277 nm; 流动相为色谱纯乙腈:水(含0.1%甲酸, 河南发酵废水处理,色谱纯)=20 :80(体积比); 流速为0.7 mL ·min-1; 温度为35℃; 进样体积为10 μL.COD、氨氮和MLSS分别采用重铬酸钾法、纳氏试剂分光光度法和重量法[30]测定; TOC采用TOC-VCSN总有机碳分析仪(日本岛津)测定.

  2 结果与讨论2.1 不同CIP投加浓度下MBR中微生物群落解析2.1.1 活性污泥的微生物群落结构

  不同CIP投加浓度下MBR污泥中微生物群落在门、纲、目、科、属等分类水平上的平均种类分布如图 2所示.门、纲、目、科、属等5个分类水平微生物种类数分布大体上都随着CIP投加浓度和运行时间的增加呈现减少的趋势.


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